山羊脊柱横突间植骨中生物工程骨研究

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1材料与方法

1．1材料

实验动物：断奶后（2~6个月）的关中奶山羊，均由西北农林科技大学提供。主要试剂：胎牛血清、分离液、胰蛋白酶、EDTA、地塞米松、β-甘油磷酸钠等试剂盒以及抗体均购于武汉博士德公司，其他试剂为国产分析提纯。

1．2实验方法

1．2.1动物模型选取选用断奶后的关中奶山羊12只，雌雄不限，采用随机区组设计的方法将实验动物分成2组。1．2.2原代BMSCs的提取与培养选取断奶的关中奶山羊，骨髓的抽取和MSCs的分离、培养按照马勇江的方法进行。

1．2.3细胞鉴定取培养第2代细胞，首先用0.25%的胰蛋白酶消化，然后用PBS（磷酸盐缓冲液）调整细胞浓度至1×107个/ml，细胞鉴定采用CD34-FITC、CD90-PE、CD14-perCP、CD54-APC对细胞标记，置4℃避光孵育30min以上，采用PBS洗1次，应用流式细胞仪进行表面抗原检测。

1．2.4细胞诱导取第2代细胞移入HG-DMEM液进行培养诱导。

1．2.5矿化诱导鉴定采用碱性磷酸酶染色鉴定。

1．2.6腺病毒介导的VEGF转染选择生长良好的传代细胞，待其生长至70%汇合时，用AdVEGF165转染（感染倍数为50∶1），设置对照组（只加DMEM）。2组终末体积用含10%新生牛血清DMEM调至5ml，24h后，换液加入含10%新生牛血清DMEM10ml中，于37℃、5%的CO2条件下培养。分别于第1、3、5、7、9、11、13和15d收获上清,离心后-70℃保存。上清标本统一用VEGFELISA试剂盒检测VEGF浓度。

1．2.7复合物培育将环氧乙烷消毒备用的大小为30mm×5mm×5mm的珊瑚羟基磷灰石仿生人工骨分别放置于6个培养皿中，每皿分别加入浓度为2×106个/ml的已转染成功的MSCs，然后放入5％的CO2、37℃孵箱中培养，每天观察细胞在材料上及周边的生长情况，并照相记录。隔天换液，培养3d，备用。

1．2.8手术方法全身麻醉取俯卧位，备皮，采用2%碘伏消毒术区，沿双侧腰背筋膜纵向切开，分离最长肌和多裂肌，显露双侧L5、6棘突，去除部分皮质骨后彻底止血，然后按照分组的不同于双侧横突间各自植入基因增强人工骨骨条和自体骨条，肌肉覆盖固定，最后逐层缝合切口并包扎。于术前、术中、术后各用青霉素20×104U肌注，植入后1～3d每日20×104U青霉素肌注，植入后分栏饲养，不限活动。

1．2.9手法触诊检查植入物硬度，轻柔检测L5、6活动度，无活动判定为融合，有活动判定为不融合。

1．2.10影像学检测术后4、8、12周每只山羊拍摄前后位X线片，观察植骨处骨小梁长入情况。有连续骨小梁长入的判定为融合，其他情况为不融合。

1．2.11组织学检测12周后将动物处死，取出植入物，福尔马林固定24h，环锯水平修整后脱水，甲基丙烯酸轻乙基酯（GMA）和甲基丙烯酸丁酯（BMA）混合液浸透后包埋、切片，厚度为5μm。切片行HE染色，观察。

1．2.12生物力学检测处死动物后取受力方向的骨块，大小为4mm×4mm×3mm，用材料试验机测试，加载速度为2mm/min。采用点压技术和直径2mm的圆柱形压头，计算压穿软骨下骨板时的压缩强度（从开始加载的基点至断裂点峰值之间的压力与压头面积的比值），在应力应变曲线上计量其弹性模量。

1．3统计学方法

采用SPSS13.0软件进行统计学处理，定量资料采用均数±标准差（x±s）表示，组间差异采用方差分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2．1细胞鉴定结果

刚接种的细胞为球形悬浮在胞液之中，混有少量的血细胞，4~5d后换细胞液，可见大量单核细胞呈圆形，未完全贴壁；8~10d后换细胞液，可见单核细胞完全贴壁，变成梭形及多角形，12d后大量单核细胞连接成片，形成纤维样细胞集落，15~20d后细胞逐渐汇集，多呈长梭形及多角形，流式细胞仪检测CD90和CD54为阳性，CD34和CD14为阴性，符合骨髓间充质干细胞表面抗原特征。

2．2成骨细胞诱导鉴定

12～14d基质矿盐形成钙化结节，碱性磷酸酶染色可见胞浆被染成棕黑色，并有黑色颗粒沉积，说明培养形成的细胞具有成骨细胞的特性，具有体外成骨的能力（此种细胞含量超过80%）。

2．3VEGF转染结果

结果显示转染组细胞培养上清液中VEGF分泌显著高于未转染组（P<0.01），分泌高峰在7～9d，此后逐渐下降，15d仍然可检测到，且依然高于对照组。

2．4手法触诊

所有实验动物均存活且未见异常反应，4周后均有活动度，8周后CHA-MSCs-VEGF组无活动度，12周后2组均无活动度。

2．5影像学检测

4周后均未见骨小梁，8周后开始2组均可见骨小梁。

2．6组织学检测

CHA-MSCs-VEGF组术后12周有少量软骨及大量的连续骨小梁形成，可见皮质骨围绕，可见软骨结构形成，之后成骨，成骨代谢活性已非常接近正常，植入材料与骨组织达到骨性融合，自体髂骨组术后12周可见新生骨组织形成，但其成骨能力不及CHA-MSCs-VEGF组。

2．7生物力学检测

CHA-MSCs-VEGF组与自体组在最大压缩强度和弹性模量2方面差异无统计学意义（P＞0.05）。

3讨论

MSCs是近几年来研究最热门的干细胞，具有在一定的培养条件下，可以分化为骨细胞，维持一定时期内细胞的生长形态稳定、增殖速度较快、细胞的生存适应能力较强、贴壁时间短、成活率高等优点，是目前骨组织工程中较为理想的种子细胞。本实验采用Percoll梯度离心法，成功分离MSCs，并诱导其向成骨细胞分化。支架物质CHA是以特定的天然优质珊瑚为原料，经过一系列复杂的热液置换反应，将珊瑚中的矿物质转换为羟基磷灰石并保留了珊瑚天然的孔隙，得到物理结构和无机成分与人体骨相似的产物，其不仅具有一定的机械强度和骨诱导物质融合面积，而且其植入机体组织后有良好的生物相容性，不产生局部或全身性毒性反应，无炎症排斥反应，具有良好的成骨潜能。为了促进上述人工骨能更好地与机体组织融合，本研究还加入了血管内皮生长因子（VEGF），其为机体内促进血管生长的最重要的生长因子，在体内外均可以特异性促进血管内皮细胞的生长并诱导血管生成。众所周知，临床骨折的愈合快慢与病损处血供有着密切的关系，将VEFG基因转染入人工骨的构建之中，可促进骨组织血管的形成、加速骨质间的融合和生长。本实验中，由触诊和影像学检测发现，该基因增强人工骨在融合速度上快于自体髂骨，从组织切片上可看出，其成骨的质量上比自体髂骨更加成熟，在生物力学的检测中，该人工骨在最大压缩强度和弹性模量上均接近正常骨组织。综上所述，CHA-MSCs-VEGF三联人工骨复合物具有取材方便、培养简单、相容性好、成骨迅速、生物力学强度高等优点，有望广泛应用于临床植骨融合手术中骨骼的替代材料。

作者：朱海燕 邹浩 甘一波 冯建军 王永安 单位：襄阳东风人民医院骨科