果蝇培养实验注意事项分析

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【摘要】果蝇作为一种重要的模式生物，分布广、易获得、生活史短、遗传变异易于检测，适于实验室研究。本文在简要分析果蝇实验室培养传统方法的基础上，从瓶塞制作、问题处理和管理方法等方面对果蝇培养实验中的注意事项进行了探析。

【关键词】果蝇；培养；实验

果蝇原产于美洲,是完全变态发育的昆虫。果蝇的发育要经过卵、幼虫、蛹、成虫等几个时期，从卵到成虫只要10d左右，一年可以繁殖30代，在实验室中却常常出现生长迟缓甚至停滞、繁殖缓慢等问题，对实验进程带来不利影响。为保证实验如期取得成果，果蝇在实验室中的保种和繁育技术显得十分重要。

1果蝇的基础培养

1.1培养基的配置

果蝇的培养基有很多种。经典常用的果蝇培养基的配方为：琼脂4.5g、玉米粉24g、酵母粉48g、葡萄糖66g、1g/ml尼泊金甲酯9ml、补水60ml。高境鸿等的研究发现使用活酵母培养基可以大大提高果蝇的平均寿命，缩短果蝇发育周期[1]。但在使用过程中，活酵母培养基容易腐烂变质，散发异味，或培养基底部出现气体将整个培养基床抬高，对果蝇发育空间造成影响。实验室应根据对果蝇研究的具体需要来选择合适的培养基。培养基配制时要不断搅拌，使培养基成分均匀，同时避免因局部温度过高而烧焦培养基。将培养基煮至微沸后冷却20min，分装至高温灭菌后的果蝇瓶(高10cm、瓶底直径6cm、瓶口直径4cm的圆锥体)或者果蝇管(高9.5cm、直径2.5cm的圆柱体)中[2]，如果使用培养管，每管内培养基高度不超过2cm，等待培养基冷却凝固，且果蝇管内壁无可见水滴时，用高温灭菌的瓶塞塞住瓶口。将需要培养的果蝇导入管内，或者于4℃冰箱中保存。4℃保存时间不能过长(不超过一个月)，防止培养基腐烂或被污染。

1.2传统的果蝇培养方法

果蝇的正常可生存温度在12℃～32℃。25℃是果蝇生长发育和繁殖最适的温度。在此温度下，果蝇的生长发育速度较快，适合进行果蝇的杂交和扩繁等操作。在18℃时果蝇的生长发育和繁殖速度会明显减慢,此温度条件下需要进行果蝇的保种。过高或过低都会造成果蝇的死亡，实验室中应该使用设备控制合适的温度，确保果蝇按需要生长。每天光照9h为宜，根据培养温度不同，每间隔2-3周更换一次培养基，在需要大量实验材料的情况下可以选择扩大培养瓶体积、数量，或间隔更短时间更换培养基，以满足实验需要。更换培养基、繁育果蝇时，把羽化的果蝇20个左右,雌雄数目大致相等的成虫移入新的培养基里。

2果蝇培养中应注意的问题

2.1无菌处理

使用高压蒸汽灭菌锅（121℃20min）将实验所用培养瓶、瓶塞、微量移液器枪头灭菌，操作前将试验台使用75%酒精杀菌消毒，挑蝇板应在更换不同培养基培养的果蝇前用75%酒精消毒。2.2合适的湿度相对湿度是果蝇生存实验中的重要因素，相对湿度过高或过低,都会对果蝇的生长发育造成影响。最适宜果蝇生长的相对湿度为50%左右。培养环境的湿度过高会使培养基发霉，导致培养基变黑、污染、无法使用。培养环境的湿度过低会使培养基变干，使果蝇不能产卵,也无法获取需要的营养。

2.3恰当的瓶塞

培养管所使用的瓶塞应具有良好的透气性。如透气性不佳，培养一段时间后会出现瓶内相对湿度过高、发霉、氧气不足等不适于果蝇生长发育的环境。带小透气孔的橡胶塞透气性差，容易造成上述这种不利情况。主要原因在于，这种瓶塞的透气孔容易被污染物堵塞，且因其透气孔很小，清理极其困难，使用一段时间后将出现严重的透气不良的状况。比较合适的瓶塞是用棉花制作内芯（要求棉量适中，不可过硬，难以塞入住瓶口或不透气。也不可过软,否则容易产生缝隙使瓶内果蝇飞出），外面用纱布包裹缠绕，细线扎口，制成稍大于培养管瓶口大小的瓶塞。这种瓶塞使用寿命长、长时间使用也不易损坏、透气性好、牢固又不与玻璃瓶口粘连，且价格低廉。不足之处是制作相对麻烦。现在实验室中常用的海绵塞经过多次高温灭菌后容易变硬变小、长时间使用后质地变脆、贴合在培养瓶玻璃上难以除去、使用寿命过短且价格偏高，性价比过低等缺点，同时具有市场供应充足，且使用方便，透气性、手感良好等优点。如实验室有足够的经济条件，使用这种瓶塞更加节省时间。除了以上介绍的这两种瓶塞之外，还有发泡棉制成的瓶塞，这种瓶塞成本较低，但孔洞较大，非常容易变形，且容易与瓶身绑材粘连，脱去绑材时非常容易从瓶口脱出，造成培养瓶内果蝇逃逸。

2.4良好的麻醉效果

在果蝇的麻醉过程中，最忌讳麻醉致死。致死情况包括以下几种：1）麻醉剂过量致死。2）因为操作不当，果蝇粘在培养基上，复苏后因无法摆脱培养基的粘附致死。3）麻醉过程中果蝇飞出，为避免污染试验环境而被人为处理致死。对于以上三种情况，在无特殊要求的前提下可以使用CO2（气体）麻醉法麻醉果蝇，具体操作方法如下：先将果蝇培养瓶横放，用充满二氧化碳气体的注射针管的针头插入瓶塞与培养瓶间的缝隙，缓慢推动活塞，将气体注入培养瓶，直至瓶内果蝇全部被麻醉。该方法可以有效避免使用传统乙醚麻醉产生的操作失误致死和乙醚引起人体产生的不适；也可以最大程度的防止果蝇飞出，保证实验材料的质量、安全和洁净。为了使用方便，也可以将针管替换为二氧化碳罐，连接软管和枪头，在使用时减少瓶塞与培养管壁之间的缝隙避免未被完全麻醉的果蝇从缝隙中飞出。在使用枪头时也要注意控制气流速度，防止果蝇在麻醉过程中被气流冲出，造成材料损失。

2.5即时处理培养基问题

培养基是果蝇在实验室中生长发育的基础。当出现以下情况时，无论培养时间多久，都应当立即更换培养基：1）培养基变色。果蝇培养期间可能出现培养基失去本来的颜色而变为红色、黑色等等，这种情况下应当更换培养基。2）培养基上长出霉菌，或瓶塞上长出霉菌。此时不仅应当更换培养基，也应当清洗瓶塞。霉菌孢子漂浮于培养瓶的整个空间,包括果蝇身上,如将此果蝇接种到新的培养基中,在4-5d后，新接种的培养基同样会长出霉菌。遇到该问题,不能再接种在发霉培养基中生长的果蝇,重新接种未长霉的果蝇。此外，还可以用周伯春的方法[3]，采取措施杀死果蝇身上的霉菌孢子，将带有霉菌孢子的成蝇倒入空培养瓶中。具体操作步骤为：棉塞上倒适量的75%酒精,再将瓶口塞紧,利用酒精具有挥发性,挥发后的酒精充满整个瓶内,从而将果蝇身上的霉孢子杀死。要注意：一是倒在棉塞上的酒精量要适量,过多果蝇易醉昏,过少杀不死霉菌孢子;二是果蝇呆在空瓶内的时间要恰当,以2d为好。3）培养基过干或过湿。出现这种情况，培养基充足的情况下可以更换培养基，也可以用王转斌的方法[4]来处理。4）培养基内的果蝇幼虫虫体变细小，变透明。这种情况应当考虑是病毒感染或者培养基成分问题，应当收集已经羽化的成虫并更换培养基批次。

2.6得当的管理方法

果蝇房机械化程度低，人工管理成本较高。果蝇的培养在一定温度下具有很强的周期性，使用日期归类可以更高效的管理实验室和培育实验材料。不同日期的培养批次按照更换培养基或接种的培养日期分类放置。在进行更换培养瓶或培养基的操作时，可以根据日期分类管理培养瓶。培养实验材料时同样根据日期批次来收取成蝇，这种方法可以控制收取到的成蝇所处的生理周期为实验最适，也同时管理了不同生理周期的果蝇批次。按照日期批次记录和管理，可以大大提高实验室管理效率，减少工作量。

3结语

为保证实验室果蝇正常培养繁育，需要正确的培养基配比、控制温度、控制光照。特别要注意实验前各种器具的无菌化处理，保持合适的湿度，选用恰当的瓶塞，达到良好的麻醉效果，即时处理培养基问题，采取得当的管理方法，从而高效优质的得到实验结果。

参考文献

[1]高境鸿,崔超杰,李俊玲.不同培养基配方对果蝇生长的影响[J].生物技术世界,2015(11):280.

[2]王霞,乔欢欢,潘丽霞等.果蝇新品系开发与种质资源保存[J].实验动物科学,2016(3):412.

[3]周伯春,汪珍春.培养果蝇三龄幼虫的小技巧[J].生物学通报,2012,47(3):61.

[4]王转斌.果蝇的保种技巧及唾液腺染色体的制备[J].实验技术与管理,2002(3):37-39.

作者：尹佳宁 单位：济南大学生物科学与技术学院