氧化应激在糖尿病性角膜病变中研究

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摘要：据统计，目前约有46%～64%的糖尿病患者罹患糖尿病性角膜病变。随着糖尿病患病率的日益攀升，糖尿病性角膜病变逐渐受到眼科医生的重视，但其发病机制尚未明确。氧化应激是机体内活性氧和活性氮产生过多，从而损害机体组织细胞的一种病理过程，其参与众多疾病的发生发展，在糖尿病眼部并发症中亦扮演重要角色。本文回顾氧化应激在糖尿病性角膜病变发病机制以及治疗中的研究进展，希望对临床诊疗有所助益。

关键词:糖尿病性角膜病变;氧化应激;发病机制;研究进展

0引言

根据国际糖尿病联盟(IDF)的最新统计，全球现有约4．64亿糖尿病(diabetesmellitus，DM)患者，患病人数约占全球成年人口的9．3%，其中中国约有1．164亿患者，数量位居世界第一［1］。以糖尿病视网膜病变、并发性白内障、糖尿病性角膜病变(diabetickeratopathy，DK)为代表的DM眼部并发症严重影响患者视力，降低患者生活水平，是眼科医生一直较为关注的领域。氧化应激(oxidativestress，OS)是指细胞内促氧化和抗氧化平衡失调，导致氧化作用增强的一种氧化还原状态，它参与众多疾病的发生发展。OS在DM眼部并发症的作用既往已有较多研究，但主要集中在糖尿病视网膜病变，随着DK发病率上升日益受到重视，OS反应在DK中的作用愈显重要，本文对此项研究进行综述。

1DK的病理表现和发病机制

DK一般表现为眼部外伤或术后持续性角膜上皮缺损、愈合延迟、浅层点状角膜炎，逐步发展为角膜溃疡［2］，而这些体征均源于高糖对角膜各层组织细胞的损害。其病理表现主要包括［3－4］:(1)上皮细胞增殖和迁移受到影响，细胞间的黏附下降;(2)上皮基底膜增厚，其间的半桥粒数目减少伴有晚期糖基化终末产物(advancedglycationendproducts，AGEs)的沉积;(3)角膜基质中的锚原纤维组织减少，导致其与基底膜之间的连结变松;(4)角膜内皮细胞密度降低，形态异常;(5)角膜基底神经丛纤维长度变短、纤维密度以及分支数量均减少。DK的发病机制主要包括三大类:(1)糖基化终末产物的沉积;(2)有关上皮修复信号通路活化的抑制;(3)氧化应激反应。这三类分子机制并非独立参与DK的发生，而是共同作用进而导致细胞凋亡、细胞坏死、激发炎症反应，最终损害角膜。

2OS与DM

OS是指活性氧(reactiveoxygenspecices，ROS)和活性氮(reactivenitrogenspecices，RNS)的产生与机体内抗氧化防御系统的清除相失衡，造成ROS和RNS过多，进而对机体组织细胞产生损害。有研究证明［5］免疫细胞在病原体防御中发挥吞噬作用时，ROS起着至关重要的作用，这说明轻度OS对机体新陈代谢有积极影响，产生了一定的保护作用。然而ROS、RNS的产生与机体内抗氧化防御系统的清除平衡一旦被打破，过量的ROS不仅会损伤组织细胞的核酸、蛋白质等生物大分子，还会引起机体代谢途径异常，导致一系列疾病的发生。既往研究表明［6－7］，OS与癌症、帕金森病、阿尔茨海默症、动脉粥样硬化、心力衰竭等多种疾病的发生发展有关，同时也在DM相关并发症中起重要作用。DM患者血液中持续的高血糖水平会通过增加线粒体氧耗量损伤线粒体功能，导致线粒体功能障碍，还因激活NADH/NADPH氧化酶从而上调ROS水平，同时增强一氧化氮合酶(NOS)活性导致一氧化碳(NO)合成增加以及抗氧化剂(例如超氧化物歧化酶、谷胱甘肽和多种维生素)表达降低，进而导致机体组织细胞氧化还原状态失衡［8－11］。

3OS与DK

DK的发病是一个复杂的过程，而OS贯穿其中。慢性的高糖状态会从多个方面影响角膜组织细胞包括角膜神经的正常生理状态。例如AGEs的沉积、炎性反应激活、线粒体功能障碍等，然而这多个途径最终汇集于一点及ROS/RNS的增多及OS反应，OS会引起脂质过氧化、蛋白修饰、DNA损伤进而导致细胞凋亡、坏死、角膜神经节段性脱髓鞘、轴突变性、角膜神经功能障碍最终引起DK［12］。下文将分述OS如何与DK发病机制中的各重要物质相互作用。

3．1OS与AGEs

在DK中的相互作用AGEs是一组在蛋白质、脂肪酸或核酸的氨基基团与还原糖的醛基之间发生非酶性糖基化反应(又称Maillard反应)所形成的一系列具有高度活性终产物的总称，其结构具有高度异质性，最早由Maillard于1912年发现［13］。糖尿病患者在长期高糖状态下体内合成过量AGEs蓄积在角膜各层，通过与糖基化终末受体(receptorforadvancedglycationendproducts，RAEG)的相互作用激活NADPH氧化酶，导致氧自由基的形成影响下游多条代谢通路，同时过量的ROS产生诱导RAGE表达，从而启动正反馈循环，加剧氧化应激和炎症的恶性循环［14］。AGEs与RAGE结合还导致MAPK、JAK/STAT等信号通路的激活，增加单核细胞趋化蛋白－1(monocytechemotacticprotein－1，MCP－1)、白细胞介素－6(interleukin－6，IL－6)、肿瘤坏死因子－α(tumornecrosisfactor，TNF－α)和血管细胞黏附分子－1(vascularcelladhesionmolecule－1，VCAM－1)的表达，引起炎性反应。RAGE的激活也可导致内质网应激和细胞凋亡［15－17］。有研究表明，通过抑制AGEs可以降低OS反应，对组织起到保护作用。Kim等［18］团队将一种四味草药提取物制成的药物KIOM－79通过口服用于2型糖尿病大鼠模型，13wk后发现实验组小鼠角膜厚度和细胞凋亡程度明显低于对照组，且各层角膜组织AGEs的积累减少。此外，通过对相关标记物的检测，其团队还发现KIOM－79减弱了角膜中的氧化性DNA损伤、NF－κB激活和Bax过表达，说明其通过抑制氧化应激反应对角膜起到了保护性作用。大量报道显示［19］，许多类型的天然化合物，如多酚、多糖、萜类、维生素和生物碱，都是抑制AGEs形成的良好候选者。这些化合物通过清除自由基、螯合金属离子、捕获活性羰基化合物、覆盖蛋白质的糖化位点和降低血糖水平来阻止AGEs的形成。

3．2OS与沉默信息调节因子

1在DK间的相互作用沉默信息调节因子1(SIRT1)是一种具有代表性的组蛋白脱乙酰酶，作为Sirtuin蛋白家族的一员，其酶活性依赖于NAD+作为辅助因子。SIRT1通过组蛋白修饰控制基因表达、DNA修复、代谢、氧化应激反应、线粒体功能等来调节多种细胞活动［20］。SIRT1调控氧化应激的机制主要包括:(1)通过去乙酰化激活过氧化物增殖子激活－受体因子γ辅激活因子(peroxisomeproliferator－activatedreceptorcoactivator－1，PGC－1α)的基因转录，并通过调节核受体过氧化物酶体增殖物激活受体(PPAR)、核呼吸因子(NRF)和线粒体转录因子A(TFAM)等基因的转录，参与调节线粒体功能［21］以及葡萄糖和脂质的代谢［22］。(2)SIRT1调节抗氧化剂如超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶的表达［23］。此外，由于线粒体功能障碍会导致细胞凋亡，SIRT1可以通过介导PGC－1α的乙酰化直接调节细胞凋亡过程［24］。SIRT1还通过调控NF－κBp65的乙酰化水平控制炎症反应，同时调控炎症因子相关基因的表达:如白细胞介素(IL)－1、肿瘤坏死因子α(TNF－α)、IL－8、IL－6等［21－22，25］。近年来，关于SIRT1对DK作用机制的研究逐渐增多，且OS是不可或缺的一环。Wei等［26］研究发现在1型DM小鼠模型中，SIRT1的下调可促进ROS的产生、抑制角膜上皮细胞活性促进细胞凋亡，可望通过调节SIRT1的表达影响细胞内质网应激进而起到对DK的保护作用;Liu等［27］通过建立DM相关干眼小鼠模型观察到相对于普通干眼对照组，OS反应显著增强伴SIRT1表达下降;Li等［28］发现NAD+含量和NAMPT表达在1型DM小鼠和2型DM患者中均下降，细胞实验证明体外补充NAD+可恢复角膜上皮细胞增殖和迁移的能力，此外，在DM小鼠中，NAD+及其前体烟酰胺单核苷酸(nicotinamidemononucleotide，NMN)和烟酰胺核糖苷(nicotinamideriboside，NR)也促进角膜上皮和神经再生，同时还伴有SIRT1、磷酸化的上皮生长因子受体(epidermalgrowthfactorreceptor，EGFR)以及AKT和ERK1/2的表达增加。

3．3OS与炎性反应在DK中的相互作用

炎症是机体对病原体入侵、组织损伤和刺激物等各种病理过程的重要生理反应。慢性炎症主要通过自由基的持续和过量产生以及抗氧化剂的消耗导致细胞损伤［29］。ROS可以刺激核因子－κB(NF－κB)和激活蛋白－1(AP－1)等转录因子，增加促炎细胞因子的表达。因此，有理由认为靶向氧化应激－炎症细胞因子信号通路可能是治疗糖尿病并发症的潜在策略［30］。人高迁移率族蛋白B1(high－mobilitygroupbox1protein，HMGB1)是一种在转录调控中起重要作用的非组蛋白核蛋白［31］，HMGB1是介导糖尿病并发症一关键的炎症介质。它通过与晚期糖基化终末产物受体(receptorforadvancedglycationendproducts，RAGE)、Toll样受体(TLR2和TLR4)结合激活NF－κB，进而导致促炎因子、黏附分子和血管生成因子的上调。Hou等［32］研究表明，HMGB1及其相关受体与DK的发生发展密切相关。蛋白质印迹结果显示RAGE和TLR4(HMGB1受体)以及HMGB1相关信号通路也可能参与糖尿病角膜伤口和神经愈合。促炎性HMGB1信号转导途径主要通过其两个受体TLR和RAGE进行转导，最终增加NF－κB的活化和促炎性细胞因子的产生，包括TNF－α，IL－1β和IL－6。NF－κB的激活和促炎细胞因子的产生反过来又可以诱导HMGB1及其受体的表达，从而导致过度和持续的炎症反应正反馈循环。给予外源性HMGB1肽可以明显抑制糖尿病眼损伤后角膜上皮/角膜神经的恢复，而甘草酸二钾(dipotassiumglycyrrhizinate，DG)(HMGB1抑制剂)治疗可以显著加速这种恢复过程。HMGB1的两个受体RAGE和TLR4也被发现参与糖尿病患者角膜上皮/角膜神经愈合过程。这些结果表明HMGB1信号通路在DK的发展中起着至关重要的作用，有望通过对HMGB1的抑制调控炎症反应进而治疗DK并促进角膜神经修复。

3．4OS与内质网应激

在DK中的相互作用内质网(ER)是一种专职于蛋白质折叠和运输的细胞器，对细胞内稳态和细胞外刺激的变化高度敏感。内质网应激(endoplasmicreticulumstress，ERS)主要是由ROS积累、毒性物质、基因突变等引起应激反应，其应激原主要来自细胞内部环境改变，包括蛋白错误折叠、钙稳态失调、未折叠蛋白聚集等内质网功能紊乱［33］。研究发现ERS和OS存在相互作用:OS可诱导ERS，相反ERS也可以促进细胞内ROS生成。正常状态下，细胞内部分ROS来源于内质网的氧化蛋白折叠过程中二硫键的形成，该过程中蛋白二硫化异构酶(proteindisulphideisomerase，PDI)通过内质网氧化酶1α(endoplasmicreticulumoxidase，ERO1α)转移电子给分子氧，相继生成了副产物过氧化氢［34］。高糖状态可诱发ERS，上调的PDI和ERO1α可导致大量过氧化氢形成，同时细胞代偿功能有限，生成的还原性谷胱甘肽不足以中和超量的过氧化氢，继而引起OS损伤。伴随着细胞内线粒体裂解和钙超载，ERO1α介导的内质网钙离子的释放，亦可引起线粒体超氧化物的生成［35－36］。Wang等［37］的研究发现，中脑星形胶质细胞源性神经营养因子(MANF)在小鼠和人的角膜广泛存在，其促进糖尿病患者角膜上皮修复和神经再生。主要机制是通过调控Akt信号通路抑制了高糖环境所致的细胞内质网应激及ERS介导的细胞凋亡，MANF有望在改善DK患者角膜上皮延迟愈合和神经损伤再生中扮演重要角色。

4DK氧化应激的治疗

4．1甘草酸

甘草酸(glycyrrhizin，GLY)是一种从甘草根中提取的皂苷类物质，具有抗炎等多种药理作用，其已被证明对败血症、结肠炎脑损伤、角膜炎的动物模型有效［38－40］，在临床上已被用于治疗慢性肝炎患者。Somayajulu等［41］将GLY作用于高糖培养的小鼠角膜上皮细胞，发现其具有一定的保护作用，且降低了促炎症反应和OS标志物如HMGB1、IL－1b、TLR2、TLR4、NOD样受体蛋白3炎症小体(NOD－，LRR－andpyrindomain－containingprotein3，NLRP3)、环氧合酶－2(cyclooxygenase2，COX2)、超氧化物歧化酶－2(superoxidedismutase2，SOD2)血红素氧合酶－1(hemeoxygenase－1，HO－1)、谷胱甘肽过氧化酶2(glutathioneperoxidase2，GPX2)的表达量。另外该团队在糖尿病小鼠模型的饮水中给予GLY，发现与对照组相比除了上述标志物，C－X－C型趋化因子配体2(C－X－Cmotifchemokineligand2，CXCL2)和诱导型一氧化氮合成酶(induciblenitricoxidesynthase，iNOS)表达也下降，这进一步说明GLY对高糖所致的OS具有保护作用。

4．2色素上皮衍生因子

色素上皮衍生因子(PEDF)主要由视网膜色素上皮合成，是一种50kDa的分泌蛋白，属于非抑制性丝氨酸蛋白酶抑制剂超家族的一员［42］。它也存在于角膜、结膜和睫状体上皮细胞、穆勒神经胶质细胞、视网膜星形胶质细胞和视网膜神经节细胞［43］。大量研究证明PEDF可以降低RAGE的表达并发挥抗氧化作用，Liu等［44］选取6周龄小鼠注射STZ建立1型DM小鼠模型，并给予50nmol/L量的PEDF滴眼每日3次，持续8wk后发现与给予人工泪液的DM对照组小鼠对比，其角膜上皮染色评分降低且泪液分泌量和角膜敏感性均有显著提高。进一步对小鼠角膜行组织学检测发现PEDF可减少DM小鼠角膜中ROS的累积、降低RAGE的表达以及增加抗氧化剂SOD1的表达，说明PEDF对DM所致的眼表损伤具有保护作用。

4．3α－硫辛酸

α－硫辛酸(alpha－lipoicacid，ALA)是一种天然存在的低分子量(206．32g/mol)二硫醇微量营养素，作为与线粒体代谢相关的生物能酶活性的辅助因子，它参与体内的物质代谢中的酰基转移，能消除导致加速老化与致病的自由基。ALA的潜在抗氧化作用可归因于直接活性氧(ROS)清除能力、金属离子螯合能力和恢复细胞抗氧化剂的能力，如还原谷胱甘肽(GSH)、辅酶Q、维生素C和E水平。研究证明［45－47］ALA具有抗氧化的生物活性，对心血管疾病、炎症、衰老和阿尔茨海默病认知功能障碍具有保护作用，因而其药理机制受到关注。另外关于ALA的大多数临床研究显示了其在减轻DM患者的OS、神经病变和神经病变相关疼痛和感觉异常方面也具有较强潜力［48］。

5展望

OS参与众多疾病的发生发展，其重要性体现在连接包括异常代谢、炎症反应以及ERS等多种发病机制。目前OS在DM眼部并发症的研究主要集中在糖尿病视网膜病变，在DK中的研究尚有不足，且多局限于角膜上皮损伤修复，未来OS在DK的发病机制中的作用有待进一步研究。

作者:黄钰清 杨燕宁 单位:武汉大学人民医院眼科中心