浅谈microRNA在医检中的应用

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MiRNA的检测技术很多，既有传统的Northernblotting技术、实时定量PCR技术和RNA芯片技术，也有最近发展起来的结合物理和化学方法建立的银染增强放大技术、共振能量转移技术、拉曼光谱分析技术和生物传感技术等。

1Northernblotting技术

该技术是目前很可靠的检验技术，但是所需要的样品较多，检测周期也比较长，其敏感性也不是很好。为此研究人员发展了LNA技术。LNA是一种类寡核酸的衍生物，使用其进行杂交可显著提高杂交的敏感性和杂交效率，大约是传统杂交方法的10倍，而且并且仅用2h完成。［3］此外，，Pall等［4］采用了可溶性的碳化二亚胺来代替传统的紫外交联法把miRNA转移至尼龙膜上，使检测敏感度提高了25－50倍。通过以上这些改进，Northernblotting技术将在很大程度上促进miRNA检测技术在临床实验宅的顺利开展。

2实时定量PCR技术

其是检测miRNA最常用的技术。可用于检测各种组织中的miRNA表达以及表达量，包括血液、肿瘤组织以及其他病理组织等。Mitchell等使用经典的Taq-Man荧光定量RT－PCR技术定量分析了健康志愿者血浆中的miR－15b、miR－16和miR-24。同时，他们还使用该方法定量测定了从前列腺癌血浆标本中筛选出来的6个miRNA，结果显示，miR-141在前列腺癌患者血浆中的表达量明显升高(是健康人的46倍)，同时他们对miR-141的表达水平同PSA的水平进行了相关性分析，发现了二者存在一定程度上的相关性。［5］才外，肖丙秀等课题组使用通用引物进行逆转录，可以用一次RT产物用于检测多种miRNA，很大程度上节省了宝贵的材料，也提高了检测的效率，对于临床分析有很高的参考价值。［6］

3miRNA芯片技术

这种技术包括微阵列芯片技术和微流体芯片技术。微阵列芯片技术是将大量的寡核苷酸以高度有序的微阵列的形式排列在某种固相支持物上从而检测特定基因表达。优点是可以一次就可以高通量的分析多个基因的表达情况，而且可以鉴别特意表达的基因。而微流体芯片技术是根据经典的分离理论，也就是不同大小的分子其流动性也不同。肖丙秀等课题组利用该技术初步鉴定出了一批在胃癌组织中高表达的miRNA：R-20b、miR-20a，miR-17、miR-106a，miR-18a，miR-21，miR-106b，miR-18b，miR-421、miR-340+、miR-19a和miR-65，为胃癌的诊断提供了有价值的参考资料。Tan等也利用该技术建立了脑卒中患者外周血miRNA的表达谱。此外采用该技术还可以实现对miRNA表达的绝对定量，具体方法为先测定标本中所有miRNA的表达谱，然后挑选出若干不表达的miRNA，随后在标本中按照浓度梯度定量加入这些miRNA进行水平杂交，最后再测定荧光强度，进而绘出标本中不同miRNA的荧光强度曲线，根据曲线确定其表达量。

为了使芯片技术更方便于开展标准化检测和质量控制，美国食品药品监督管理局在2005年展开了一项芯片质量控制计划，该计划正致力于miRNA芯片检测的标准化研究，这对该技术走向临床领域有着重要的借鉴意义。最新发展起来的miRNA检测技术中，共振能量转移技术可以使用QDs做标记物对生物大分子的活性没有伤害，比较适于活细胞内miRNA的分析。这里重点介绍下生物传感器技术。目前在医学检验领域，生物传感器发挥着越来越重要的作用。生物传感器是由生物识别部分和高度灵敏的信号传感放大器件构成。有很多的优点，比如体积小、灵敏度高、成本低、检测迅速和易于自动化等。其中在核酸检测中，生物识别部分主要是负责特异性结合待测核苷酸。近几年来纳米技术的引入大大提高了miRNA检测的准确性和灵敏性，这种方法迅速壮大。有希望成为临床检测各种疾病标志物的有效方法。

作者：陈跃龙 单位：楚雄医药高等专科学校