拉曼光谱在检验医学中的应用分析

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拉曼光谱（Ramanspectra）属于散射光谱范畴，是光与物质相互作用而产生的［1］。在20世纪20年代由印度科学家C．V．拉曼首次发现并命名。单色光入射到某一介质后产生的散射光大部分只发生方向的改变，其频率与入射光保持一致，称为瑞利散射；另有极少数散射光，其传播方向及光波频率均发生改变，这样的散射就称为拉曼散射［2］。拉曼首次提出分子可以改变入射光频率的理论，且改变量与散射层面分子的化学结构相关联。后续研究发现散射层面的分子结构、分子基团以及电子化环境均会对散射光频率产生影响，而这些影响是根据材料特定的，从而可以通过散射光特点对物质进行定性和定量分析［3］。由于拉曼光谱技术及由拉曼光谱术衍生出的亚技术在物质检测方面具有高效、简便、无破坏性、成本低、非接触性、样本量少、样本无需特殊制备、可重复性高、稳定且不会对被试样本造成物理和化学分解破坏等特点已被广泛应用于化工、刑侦、生物制药、医学检验等领域，并取得了多项进展，是目前无损分析检测领域的关注焦点［4－6］。近年来利用拉曼光谱技术开展的各项病变组织的检测和疾病诊断分析引起了医学界的广泛关注，也为现代医学检验学敞开了新的大门，促进了疾病诊断技术的发展［7］。本文就拉曼光谱在检验医学中的应用展开综述。

1拉曼光谱在医学检验中的应用

1．1在病原微生物检测中的应用

微生物细胞膜表面有大量已知的生化成分可以看作是微生物的特征性标志，因而可以作为菌种快速识别和鉴定的判断标准。利用拉曼光谱可以在不依赖培养基的情况下直接对患者体内分离下来的或实验室中保存的单一菌种或混合菌群进行快速鉴别及分析［8］。美国华盛顿州的研究人员利用拉曼光谱对从临床患者和医院环境中分离得到的7株副溶血弧菌进行了分析，结果发现7株菌株都有其各自不同于其他菌株的特征峰。他们还将其中2株副溶血弧菌菌株分别按照1∶2、1∶1和2∶1的比例混匀后分别利用拉曼光谱检测，结果显示可以通过2株细菌各自的特征峰将两者明确区别开来，其中一株副溶血弧菌的特征峰出现在了1002cm－1、1177cm－1和1532cm－1处，而另一株副溶血弧菌的特征峰却分别出现在了525cm－1、738cm－1、1319cm－1和1639cm－1处，证明拉曼光谱无论在单一菌种标本还是混合菌群标本中均具有良好的分析鉴定能力［9］。另有研究发现结合使用拉曼光谱和化学计量法可以鉴别微生物的种类及各自血清型，已有实验利用银纳米颗粒作为基底对绿豆芽中的李斯特菌、霍乱弧菌、金黄色葡萄球菌等6种食物源性致病菌进行了拉曼光谱的鉴定和区分［10］。有研究报道对日常生活中主要的食物源性致病菌进行了拉曼光谱分析，从而对细菌进行等级划分，第一级便是区分革兰阳性菌和革兰阴性菌，另外通过各自特征峰区别不同细菌菌属，结果显示各级的识别结果准确度均在91％以上［11］。利用拉曼光谱技术与微流控芯片相结合的办法，毛丽华等人设计并建立了拉曼光谱－微流控芯片自动化检测系统，检测并统计了珠蛋白生成性障碍贫血型红细胞与健康人红细胞的拉曼光谱值，通过在1004cm－1、1130cm－1、1450cm－1等拉曼光谱特征峰的数据对比，发现了珠蛋白生成障碍性贫血型红细胞的血红蛋白宽度较健康人红细胞广，并以此发现了新的快速、便捷的检测珠蛋白生成障碍性贫血的检验医学技术。另有研究者也利用拉曼光谱技术与微流控芯片相结合的办法从十多种细菌混合的菌群中对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌进行了快速分析研究。结果表明耐甲氧西林金黄色葡萄球菌较其他细菌有其独特的拉曼波峰，并且整个检测过程用时只需20s时间，在检验精度上也与传统PCR技术、免疫学检测技术所得到的结果相似［12］。该方法简便快速，安全可靠，非常适合用于卫生稽查部门的快速检验。

1．2在肿瘤检验中的应用

目前在全世界范围内依然没有很好的针对肿瘤的治疗手段，肿瘤的分期对预后起着决定性的影响，那么对肿瘤的早发现、早诊断、早治疗就摆在了尤为突出的地位［13］。在肿瘤组织中，在细胞发生病理学手段可观测到的形态恶变之前，其实已经存在由细胞增殖分裂分化或一些信号蛋白的产生等引起的细胞中遗传物质、蛋白质和脂类的结构和含量改变，而这些细微的改变可以及时通过拉曼光谱检测反映出来［14］。因而在肿瘤检验中拉曼光谱技术具有传统病理学检测所无法替代的功能用途，对肿瘤的早期诊断有巨大帮助。实验证明拉曼光谱可用于癌变组织与正常组织的鉴别。早在1991年就有人率先对拉曼光谱的肿瘤检验学价值进行了报道。他们发现正常乳腺组织与肿瘤组织甚至良性肿瘤与恶性肿瘤的拉曼光谱在700～1900cm－1存在着明显差别，且对应的各自拉曼峰相对强度也存在显著差异［15］。从此掀开了拉曼光谱应用于早期肿瘤诊断的新时代。Gawinkowski等［16］对拉曼光谱技术进行改进设计了快速近红外拉曼光谱检测系统，进一步提高了检测效率，可在5s内快速测得活体皮肤的拉曼光谱。随即该科研团队利用此系统对肺癌组织进行拉曼光谱检测，结果显示肺癌组织的拉曼光谱特征与正常肺组织之间存在明显差别。此后，该科研小组又成功获得了亚洲人种皮肤黑色素组织的拉曼光谱数据。在对胃癌的在体拉曼检测中研究人员将拉曼光谱技术与微型摄像机、图像分光仪、双极管激光发生器等结合建立了新型拉曼内镜系统，也推动了内镜技术的发展［17］。有学者利用激光作为拉曼光谱的激发光源，对15例手术切除且经病理确诊为基底细胞癌的组织标本进行拉曼照射，同时与正常皮肤组织进行对比分析，结果显示通过拉曼光谱检测可以实现对基底细胞癌的高灵敏度诊断［18］。在对鼻咽癌组织和正常鼻咽组织的拉曼光谱比较中也有相似发现，它们在1290～1320cm－1，1420～1470cm－1和1530～1580cm－1这3处波段区间均存在明显特征差异，可以作为鉴别要点。另有研究人员选用830nm波长激光对甲状旁腺腺瘤组织标本及增生组织标本中的结节区域进行拉曼照射，重复了四十多次试验，比较发现二者的拉曼光谱比较相似，但在蛋白质、脂质等某些特定波段仍存在可区别的差异，建立线性分析的数学模型可以很好地将二者区别开来［19］。对人体多处肿瘤组织的拉曼检测均得到了较好的鉴别指标，预示着拉曼光谱在肿瘤学检验中将有宽广的发展空间。

1．3在药物分析检测中的应用

拉曼光谱较早即应用于药物检验领域。早期便有科研人员用共聚焦拉曼光谱仪对盐酸曲马多进行了检测，所获得的拉曼谱带显示图谱峰形良好，峰强明显，可以较准确地反映出盐酸曲马多的化学结构信息［20］。研究人员分析了倍他米松磷酸钠和地塞米松磷酸钠这两种差向异构体的化学结构差异，分别对其固态及水溶饱和态进行了常规拉曼光谱检测，并进一步对以银胶为基底的这两种药物进行了增强拉曼光谱检测分析，成功建立了这两种差向异构体的拉曼区分系统，可以实现其快速区分鉴别的目的［21］。科研人员采用傅里叶变换拉曼光谱法对不同产地且不同采集时间的野生及人工种植黄芩进行了分析研究，结果显示利用该方法对中药材的质量鉴定较传统鉴别方法更快速简便且不会对受检样品造成破坏，值得推广。有学者在前人基础上开创性地将拉曼光谱技术与光纤传感技术相结合，实现了甲硝唑片的快速无损鉴别，尤其适合于药品监管部门对药品快速检验。

1．4在眼部疾病检验中的应用

晶状体是一具有高浓度蛋白质的双凸面透明组织，其内蛋白变化对晶状体功能改变具有决定性作用，对人眼屈光调节也有重要意义。利用拉曼光谱对晶状体蛋白质的亚结构例如：氨基酸亚基、二硫键、羧基、巯基等的分析可以帮助人们更好地认识晶状体及其调节模式。拉曼光谱技术引入眼部疾病的研究首先是测定了牛晶状体中α、β和γ蛋白的拉曼图谱，结果显示α蛋白主要集中于核部而β蛋白主要集中于皮质部［22］。Short等［23］测试了紫外线诱导下的兔白内障晶状体拉曼光谱，结果显示氨基酸残基中的羟基谱线强度显著增加，无法与水形成氢键，从而科学地解释了白内障晶状体中水分的缺失。与此同时，研究中发现了多肽水解物的组成成分邻氨基苯甲酸，暗示着光化学反应可以造成色氨酸残基的下降。综合现有发现，他们提出了紫外线诱导白内障发生的热损伤学说。研究人员测试了诱发哺乳动物白内障的致病性光谱，以6月龄家兔为阴性对照组，以7月龄糖尿病家兔为糖尿病组，对比发现在900～1700cm－1，并无明显差异，而在800～850cm－1两组差异明显［24］。分析后认为诱发晶状体混浊的主要原因是α、β和γ晶体蛋白的不良聚合反应。

1．5在骨科疾病检测中的应用

绝大部分生物样本都有自体荧光，而荧光的强背景会对拉曼光谱造成很大的干扰，从而影响拉曼光谱的准确性。虽然关于引起骨组织光谱背景的物质尚不明确，但很有可能是一些有机基质中的某些非胶原蛋白分子［25］。如果在未处理的情况下，利用拉曼光谱对骨组织的检测很不准确。随后熊义等［26］发现了通过双氧水法降低骨组织光谱背景的方法，从而为拉曼光谱在骨组织中的研究打开了大门。骨组织在发育成熟后其密度与硬度即随生物力学环境的改变而改变，称为骨重建。在人体整个生命进程中，骨质会伴随着有所改变，利用拉曼光谱可以对这一过程进行深入研究。一旦吸收与沉积的动态平衡被打破，则会造成不同类型的骨科疾病。Oshokoya等［27］建立了以拉曼光谱为研究手段的外力作用下的颅缝早闭模型，研究内容涉及颅骨成分、骨质及基质的相对含量和分布。颅缝早闭症是一种由多病因造成的颅缝发育异常综合征，在婴幼儿属于常见疾病，由于颅缝过早闭合，限制了颅腔的容积，不利于智力的发展。结果显示在非轴向压力的作用下成骨区的前端矿物含量相比无压力的状态下有所下降，其原因可能是矿物沉积不完全［28］。在成骨不全症的研究中，有学者利用拉曼光谱证实了成骨不全症小鼠在6月龄后的骨强度增长不是由于骨形态改变引起的，而是由于骨基质的改进而达成的［29］。

2展望

纵观历史，人们已针对各种动物各种组织器官开展了大量的拉曼光谱研究并获得很多突破性的进展，发明了许多新的检验技术。拉曼光谱在医学检验中的作用越来越凸显，并且越来越多的科技报道证明拉曼光谱技术应用于医学检验有其独特的优势与特点，诸如快速、准确、廉价、可靠等。即使前途一片大好，拉曼光谱技术在生物医学检验学中的应用仍存在很多问题亟待解决，例如尚未建立不同物质的拉曼光谱特征峰信号库、如何建立针对具体疾病的拉曼检验标准、如何建立活体组织的拉曼检验系统、如何排除复杂组织和成分的干扰、怎样更好地与现行主流检验体系相融合等。目前仍留有很多关键性的问题亟待解决，拉曼光谱技术在检验医学中的大面积普及依然任重道远。

作者:郭美 魏昆 毛莉 刘晓红 黄君富 府伟灵 审校 单位:第三军医大学西南医院检验科