指纹图谱在茶叶研究上的运用

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GC-MS指纹图谱技术通过分析茶叶香气，在茶叶质量评价和身份鉴定方面有一定作用。GC的优势在于挥发性成分的测定，对于茶叶中不挥发性成分，可用裂解气相色谱进行测定。张铭光等[8]采用热脱附-裂解色谱法测定了普洱茶色谱指纹图谱，并选用模糊聚类数据处理手段对图谱进行综合分析，该指纹图谱能较好地反映普洱茶因产地、工艺加工、存放地点、存放时间所产生的差异，为普洱茶的品质鉴定提供了一种快速、简便、科学的测试手段。

与GC相比，除了同样具有分离效能高、分析速度快等特点外，高效液相色谱（HPLC）不受样品挥发性和热稳定性限制，应用范围广，60%~70%的有机化合物均可应用，并且通过与不同检测器联用，可以有针对性地检测分析样品中不同的化学成分。如使用二极管阵列检测器（DAD），可以得到不同波长下的色谱图，计算机处理后可获得三维图谱，适用于成分复杂物质的定性和定量分析[9]。HPLC方法应用于茶叶组分分析时间并不久，直到1976年Hoefler和Coggon[10]才首次采用液相色谱法测定了茶叶中组分，为茶叶指纹图谱分析提供了研究方向。Pedro等[11]采用HPLC分析法对肯尼亚、印度、日本等国家以及中国云南的普洱茶、福建的乌龙茶等进行了产地区分的判别研究。罗一帆[12]根据高效液相色谱中的相对保留时间、相对面积、共有峰、重叠率、八强峰及相对总面积等对广东岭头单枞茶的色谱指纹图谱进行了分析和对比研究，建立了鉴定广东岭头单枞茶品种的色谱指纹图谱分析方法。茶多酚的药理药效越来越受到人们关注，何昱等[13]对33批茶多酚进行了高效液相色谱指纹图谱分析，并结合主要单体成分的含量检测，制作了数字化指纹图谱，认为该图谱可以作为茶多酚产品质量控制的依据。除此之外，还通过高效液相色谱法获得绿茶特征图谱，并以数字化色谱指纹图谱为基础，探讨了绿茶分类新模式，从内在组成上为绿茶的分类提供了一个客观量化的界定标准[14]。HPLC指纹图谱在茶叶研究中主要是通过测定茶叶中儿茶素、茶多酚等特征成分含量，提取茶特征成分并与模式识别方法相结合判别茶叶品种和产地。成浩等[15-16]在这方面做了很多研究，在产地识别方面，以不同类别的扁形绿茶样品为研究对象，从儿茶素和黄酮苷两类物质着手，通过大量样本分析研究，建立了不同的数字化多元HPLC化学指纹模式图谱，能较好地代表其来源样本的特征属性；在绿茶原料品种属性鉴别技术方面，建立的绿茶HPLC多元化学指纹图谱能够较好地表征茶叶样本的品种属性[17]；针对武夷岩茶分类识别的研究，借助HPLC色谱数据的多元信息融合，建立了武夷岩茶不同原料品种、不同产地区域的分类判别模型，模型对训练集样本的判别准确率达到100%[18]；在普洱茶分类研究方面，利用茶多酚类、咖啡碱及黄酮类物质含量变化的两个HPLC色谱数据，制作了滇青（晒青毛茶）、青饼和普洱茶（熟饼）3组茶样的化学指纹图谱，发现1~2年陈以内的青饼在化学成分上与普洱茶（熟饼）有着本质上的差异，而与晒青毛茶有很高的相似度，本质上还是属于绿茶[19]。宁井铭[20]对晒青毛茶的分类鉴别进行了相关研究，通过对18个云南普洱茶晒青毛茶样品HPLC图谱的分析，确定了普洱毛茶的特征指纹峰，与绿茶比较，二者HPLC图谱存在较大的差异，所得色谱图可以作为云南毛茶专属性的指纹图谱，为普洱毛茶鉴别和质量控制提供了实验依据。在此研究基础上，张梁[21]建立了普洱茶HPLC指纹图谱方法，通过对不同产地的普洱生茶和普洱熟茶的研究分析，发现不同产地的普洱熟茶和普洱生茶分别有24个共有峰和21个共有峰，并且两者因不同的发酵工艺又产生了各自特征性的指纹峰。所以，该法可以用于普洱熟茶和普洱生茶的质量评价和真伪鉴别。随着高效液相色谱仪器的普及，与质谱（MS）联用可同时得到色谱峰的结构信息，使茶叶成分分析更加深入细致。Zhu等[22]建立了茶叶及其提取物中茶氨酸、绿原酸、嘌呤碱类和儿茶素类12种化合物的HPLC和HPLC-MS分析方法，通过该法获得的谱图可以作为茶叶及其提取物中生物活性成分质量控制的指纹图谱。倪倩[23]采用高效液相色谱-质谱联用技术（HPLC-MS）及高效液相色谱法对生熟普洱茶中的8种主要成分进行定性和定量分析，并结合主成分分析（PCA）、聚类分析（CA）和判别分析方法，能准确地区分普洱生茶与熟茶。

毛细管电泳（CE）是以毛细管为分离通道，以高压电场为驱动力的新型液相分析技术。毛细管电泳作为一种快速、高效、微量、经济的分离技术，在茶叶成分分析中已有较多应用，其中毛细管区带电泳（CZE）和毛细管胶束电动色谱（MEKC）是最常用的两种模式。利用CZE分离模式，可以分析茶叶中多种生物活性成分，包括6种儿茶素类[儿茶素（C）、没食子儿茶素（GC）、表儿茶素（EC）、表儿茶素没食子酸酯（ECG）、表没食子儿茶素（EGC）、没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）]、4种茶黄素、茶氨酸、咖啡碱、茶碱、腺嘌呤和多种酚酸[24-27]，以及水溶性维生素[28]。MEKC与CZE相比，不但可以分离带电物质，还可以分离电中性的物质，它可以同时分离8种儿茶素类、咖啡碱、茶碱、可可碱[29]，但MEKC对茶黄素类的分离效果不佳[30]。宋冠群[31]用胶束电动色谱法建立了茶叶的色谱指纹谱，并用于分析10种中国名茶，实现了图谱的数据化；同时以相对保留值表示各色谱峰的峰位，提高了样品间的可比性。

红外光谱是指波长范围在400~4000cm-1之间的中红外区，因为具有良好的指纹性，所以只要茶叶的化学成分在质和量方面相对稳定，且样品前处理方法统一，其红外光谱是相对稳定的。依据此特性，张俊瑜[32]利用傅里叶变换红外光谱（FTIR）法获取了不同厂家不同年份3种普洱红茶的特征红外光谱，并发现对同一加工方式生产的红茶，随着存储时间的延长，其特征谱的差异就越明显。所以，该研究对鉴别茶叶真伪和存储年份有一定参考价值。近红外光（NIR）是指波长介于可见光区与中红外光区之间的电磁波，其关注的波数范围为4000~12500cm-1，因其具有快速简便、对样品无破坏性、无污染、成本低等特点，近年来发展迅速。茶叶中的主要成分含有近红外的主要吸收官能团含氢基团，因此根据不同茶叶在近红外区的光谱特征不同，可以将近红外区的光谱信息应用于茶叶定性定量分析品质检验工作中。Hall[33]对134个红茶样品进行了近红外光谱分析，通过对红茶水分含量、茶黄素含量和感官品评来评价红茶的来源和品质。夏贤明[34]用近红外光扫描对40个绿茶试样进行分析，建立了绿茶总氮量、游离氨基酸、咖啡碱、茶多酚这4种成分的近红外定标模型。通过标准化学法验证，得出近红外法和化学法测定结果差异不显著，确认了近红外光谱法可用于绿茶品质检验。Schulz[35]用近红外反射光谱分析绿茶的品质参数，建立测定茶多酚、氨基酸和咖啡碱的模型，结合主成分分析法，能够辨别不同树龄的茶叶。Li等[36]用可见/近红外无损检测技术对200个茶叶软饮料试样的可溶性固形物含量进行测定，并采用偏最小二乘（PLS）和多元线性回归（MLR）的多变量分析方法，建立了茶软饮料的回归模型和指纹图谱。王胜鹏[37]还把近红外光谱技术用于茶鲜叶原料的质量评价。通过建立近红外光谱与茶鲜叶含水量、全氮量和粗纤维含量间的相关性模型和质量系数方程来评价鲜叶嫩度，提出了用质量系数作为评价鲜叶质量高低的参数，为茶鲜叶原料收购和加工分级等工作提供了新思路。近红外技术除了用于茶叶及茶产品的质量品质评价工作，还用于茶叶的分类研究和品种鉴别工作。陈全胜和赵杰文[38-41]用近红外光谱技术分别结合主成分-马氏距离模式、软独立模式分类法（SIMCA）和支持向量机（SVM）识别方法，对龙井、碧螺春、毛峰、祁红、铁观音进行有效鉴别，对绿茶、红茶、乌龙茶识别准确度可达90%以上。李晓丽[42]应用可见-近红外光谱仪在325~1075nm范围内测定西湖龙井、羊岩勾青、雪水云绿等5个品种茶叶的光谱特征曲线，并结合主成分分析人工神经网络建立了茶叶品种鉴别的模型，识别率达到100%。何勇等[43]在相同的近红外光谱范围，用主成分分析（PCA）得到的8个主成分作为输入因子，以8个品种200份绿茶样品建立了一个反向传播人工神经网络（BP-ANN）判别模型，对40份未知茶样品种预判准确率达到100%。周健等[44-47]用近红外光谱技术结合不同的数据分析方法，在茶叶的分类识别和真伪鉴定方面做了深入的研究，他们利用杠杆率校正结合偏最小二乘法（PLS-DA），对武夷岩茶中的正岩茶与半岩茶识别正确率达到100%；通过主成分分析法（PCA）建立的Fisher识别函数对成品茶原料品种的定标集和验证样本的识别准确率分别为96.8%和93.5%，对地理标志茶样的训练集和验证集的识别准确率均达96.7%；采用PLS法建立的西湖龙井的预测模型，对其真伪的鉴定准确率达到100%，为其他名茶真伪鉴定的参考。对滇青、青饼和普洱茶（熟饼）的近红外化学指纹图谱的研究中，周健[48]采用欧氏距离、PCA和系统聚类等方法对其进行了定性判别分析，得出青饼的近红外光谱与普洱茶（熟饼）样品差异显著，而与其原料滇青（晒青毛茶）十分接近，这与普洱茶HPLC指纹图谱分类研究的结果[19]一致。除此之外，He[49]和周健[50]还提出两步法对茶叶进行品种或产地判别，这为原产地标识茶叶的鉴别工作提供了新思路。试验对西湖龙井、钱塘龙井、越州龙井和扁形绿茶4个类型的茶样进行近红外光谱分析并建立判别模型，首次判别使用PLS法，对定标集和验证集样本的识别准确率分别为95.28%和93.68%，对不能识别的茶样再利用欧氏距离法进行二次判别，最后对校正集和验证集茶样总的识别准确率达到98.43%和96.84%。用同样的方法对4个茶叶样本的原料品种进行识别，其准确率分别为90.3%（定标集）和83.5%（验证集）。由此可见，利用近红外技术结合多种分析模式，可实现茶叶的快速分类判定和真伪鉴定。

NMR是一种吸收光谱，可以检测多种核素，是鉴定有机化合物结构的常规方法和重要手段，在茶叶指纹图谱研究中主要用于茶叶特征成分的分析。Gall[51]首先报道了用NMR对191种绿茶的代谢产物进行描述，通过PCA与聚类分析（CA）显示龙井茶与大多数其他中国绿茶具有显著差异，与其他茶叶相比，龙井茶中茶氨酸、没食子酸、咖啡碱、EGCG、ECG含量较高，EGC含量较低；龙井茶中还发现有茶没食子素、可可碱和一些含糖化合物，这些特征成分有助于茶叶的身份鉴定。Lee等人[52]用1HNMR研究韩国济州岛3个不同茶叶产区的茶叶代谢产物，根据氨基酸、儿茶素类和咖啡碱等特征成分含量的不同，利用PCA和正交投影潜结构判别分析（OPLS-DA）等模式识别技术，可正确识别茶叶所在产区。由此可见，通过研究茶叶特征代谢产物来识别茶叶身份是可行的。陈波等[53]用1HNMR分析测定35种不同种类和产地的茶叶，检测出约20种物质，包括儿茶素类、茶氨酸、糖类、脂肪酸、咖啡碱等，所得谱图通过主成分分析实现了不同种类茶叶的区分以及铁观音产地的辨别，结果具有较好的重现性。陆玮洁[54]依据1HNMR指纹图谱与茶叶品种之间存在着较好的对应关系，利用共有峰率和变异峰率双指标序列法分析了29份不同种类、不同产地茶叶样品的1HNMR指纹图谱，能够对绿茶和红茶的品质进行准确的鉴别。

光谱法具有灵敏度高、分析速度快、检出限低、适合微量和超微量分析及同时测定多种元素或化合物等特点。光谱指纹图谱中除了常用的红外光谱、核磁共振之外，还有紫外-可见光谱（UV-Vis）、电感耦合等离子体发射光谱（ICP-AES）和荧光光谱。其中，紫外-可见光谱通常作为检测器与高效液相、毛细管电泳技术联用来建立物质的指纹图谱。荧光光谱法具有速度快、取样量少、选择性好等优点，已从茶叶成分检测运用到茶叶品质鉴别中。唐心亮[55]运用三维荧光光谱技术建立了15种茶叶样本的三维荧光谱及其等高线指纹谱，选取图谱中的4个峰值作为指标变量进行主元分析，验证了运用三维荧光光谱技术和主元分析方法实现多种绿茶品质鉴定和种类区分的可行性。茶叶中富含多种矿物质和微量元素，其含量与生长环境密切相关，所以，用ICP-AES法研究茶叶中的微量元素对茶叶品质鉴定和产地识别有重要意义。Moreda-Pineiro等[56]通过ICP-AES和ICP-MS法测定来自亚洲和非洲等地的85个茶叶样本中的Al、Ba、Ca等17种金属元素的含量，结合不同的模式识别技术，对地理原产地茶进行了分类研究。以PCA和CA为探索性技术，线性判别分析（LDA）和软独立模式分类法（SIMCA）为分类手段，得出在5%的显著性水平，LDA和SIMCA对非洲茶样分类的正确率为100%，对亚洲茶样分类正确率分别为94.4%和91.7%。但在外部样本的判别分类上，SIMCA法不能区分印度和斯里兰卡的茶样。Chen[57]利用元素指纹识别技术，通过ICP-AES法测定茶叶中的Al、B、Ca等15种元素含量，结合PCA、聚类分析、LDA、反向传播神经网络（BPNN）的多元统计分析方法，得到8个不同茶叶品种特定元素指纹，可以用于茶叶品种鉴别。McKenzie等[58]采用ICP-AES法测定白茶、绿茶、红茶、乌龙茶和普洱茶中的Al、Ba、Zn等14种元素含量，用LDA和概率神经网络（PNN）构建的分类模型对5种茶叶的识别率分别达到81%和97%。

指纹图谱分析技术除了色谱和光谱，还有电化学检测技术、电子鼻技术等。电化学检测简便、易于实现自动化，适用于茶叶的在线分析。赵哲[59]用非线性电化学振荡检测方法，通过“溴酸钠-硫酸锰-硫酸-丙酮”稳态体系，获得不同厂家、不同品种茶饮料的非线性化学指纹图谱，该方法能将冰红茶从其他茶饮料中鉴别出来，并且分析不同掺水量的茶饮料的非线性化学指纹图谱的参数信息，可以对茶饮料的质量进行评价。电子鼻是一种新型仿生检测仪器，可以模拟人的鼻子检测茶叶香气品质。Yu等[60]利用电子鼻技术对不同质量等级的绿茶进行了测定，采用BP神经网络、概率神经网络和聚类分析法来分析不同的茶样，发现电子鼻技术对不同茶叶样本有不同的响应，据此可实现茶叶不同等级的评定。史波林[61]运用电子鼻技术分析西湖龙井茶香气特征，通过顶空瓶内茶水直接混合的香气制备法、合理选择电子鼻顶空进样及信号采集参数等方法，利用软独立建模分类法（SIMCA）建立不同等级西湖龙井茶判别模型，等级分类正确率高达95%以上，实现了西湖龙井茶的智能分等分级。4问题与展望指纹图谱技术作为近年来的一个研究热点，在茶叶上的应用研究虽然取得了一些成效，但尚处于起步阶段，要让茶叶指纹图谱技术走出实验室，应用于生产实践，还有一段路要走。主要基于以下几点原因：一、茶叶种类繁多，成分复杂且不稳定。茶叶品质受种植环境、栽培措施、采摘方法、加工工艺以及贮存条件等多种因素影响，产品质量很难稳定，尤其发酵类茶叶，内在成分本身就具有不稳定性。所以，目前茶叶指纹图谱研究的模型适用范围较小，有一定的局限性。面对这些不稳定因素和繁杂的成分，如何保证指纹图谱的重现性？科学准确地评判茶叶品质？这些问题还需进一步思考和解决。二、不同技术所得指纹图谱之间的关系还需要研究。指纹图谱技术检测手段多样，从色谱到光谱；分析方法由一维发展到多维；检测技术也由单一应用发展到联用技术。而各种检测技术对同一样品指纹鉴定结果的相关性分析还没有开展类似的研究。

茶叶指纹图谱的标准化建设难，还需要大量的研究工作。首先，建立不同茶叶的标准指纹图谱工作较难。受仪器种类、品牌、分析条件和样品前处理方法等因素影响，分析方法和条件不同，指纹图谱就会有差异，实现标准化较难。其次，数学建模方法的适用性还需要研究。用于指纹图谱技术的数据处理方法主要有相似度分析、主成分分析、聚类分析、人工神经网络等，在茶叶分类研究、品质分析和质量控制中的适用性和判定的准确性还需要进一步评估。最后，茶叶指纹信息数据库的建立需要进行大批量茶叶样本的研究和长时间的数据积累。茶叶指纹图谱技术的研究虽然刚起步，但因其具有整体性、模糊性和可量化等特点，在茶叶感官评审、种类识别、品质鉴定、真伪辨别和过程控制等方面都有广阔的应用前景。未来茶叶指纹图谱技术的研究对象会以茶叶产品为中心，向整个茶叶产业辐射开来，比如对茶饮料的在线监测，对茶保健品的质量控制等。分析方法会随着仪器分析技术和计算机信息处理技术的发展，更科学准确。同时，多种分析技术优势互补也会为指纹图谱技术在茶叶上的应用发展提供助力，推进我国茶叶产业质量控制的标准化进程。（本文作者：刘英、吴曙光、尹州、吴广红、曹丽芬 单位：杭州市余杭区质量计量监测中心）