人参果抗肿瘤细胞研究

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本文作者：李丽静 张亚杰 刘 佳 吴世佳 张 淞 王 蔚 王 威 王继彦 单位：长春中医药大学药学院中药药理教研室

人参PanaxginsengC．A．Meyer为五加科人参属植物，不但其根药用且其茎叶亦供药用，并有广泛的生物学活性，但果实研究较少。课题组近10年的研究表明，人参果含有人参皂苷并具有一定的生物活性，从人参浆果中分离得到人参果总皂苷，经分离鉴定含有异人参皂苷Rh3、人参皂苷Rh2、人参皂苷Rh1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rd、人参皂苷Rc、人参皂苷Rb2、人参皂苷Rb1、β-谷甾醇和化合物K等12个化合物及5个待鉴定化合物［1、2］。为观察其抗肿瘤活性及机制，我们进行了如下研究。

1材料与方法

1.1材料与试剂人参果总皂苷为五加科植物人参PanaxginsengC．A．Mey．的成熟干燥浆果中提取的总皂苷，由课题组化学组提供。人肺腺癌细胞(SPC-A1)、人胃腺癌(SGC-7901)、人宫颈癌细胞(Hela)、人结肠癌细胞(SW-111C)和人神经胶质瘤细胞(U251)等5个人肿瘤细胞株购自吉林省肿瘤医院;噻唑蓝(MTT)和二甲基亚矾(DMSO)购自美国Sigma公司;RPMI-1640为美国GIBCO产品;胎牛血清(进口分装)、双抗、谷氨酰胺，0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液、Hank’液、0.1mol/L磷酸盐缓冲液(PBS)均购自中国协和医科大学细胞中心。二氧化碳培养箱(ESPECBNA-321D型)、倒置显微镜(日本Olympus光学工业株式会社);100级超净工作室(苏州);离心机(北京离心机厂);酶标仪(BioRad560型);透射电子显微镜(TECNAIG2，荷兰)。

1.2细胞培养5种肿瘤细胞株按常规方法培养传代，培养于含10%胎牛血清、2μmol/L谷氨酰胺、100U/L青霉素、100mg/L链霉素RPMI-1640中，37℃、5%CO2培养箱中饱和湿度下培养，取对数生长期细胞用于实验。

1.3人参果总皂苷对5种肿瘤细胞增殖影响取对数生长期细胞，调整细胞浓度为1×108L－1接种于96孔培养板，100μL/孔培养24h后，0.5μg/ml的人参果总皂苷，同时设阴性对照组、空白对照组(即只加培养液，不加细胞以调零)及阳性药物组(5-FU)，每组均设4复孔。共同培养48h后，每孔加入20μL的5%MTT，再培养4h弃上清，每孔加入150μL的DMSO振荡10min，应用酶标仪于570nm处测吸光度值(A)。按如下公式计算抑制率:抑制率=(阴性对照A-样品A阴性对照A)×100%。

1.4人参果总皂苷对5种肿瘤细胞电镜形态学观察细胞以每瓶1×106个接种于50mL培养瓶中，培养24h后，加入0.5μg/ml的人参果总皂苷，培养0h、6h、12h、18h、24h和30h后，1500r/min离心5min，收集贴壁及悬浮细胞，细胞沉淀用2.5%戊二醛固定，再用1%锇酸固定后乙醇脱水，Epon812环氧树脂包埋，LKB-Ⅲ型超薄切片机半薄切片定位后做超薄切片，醋酸双氧铀及柠檬酸铅双重染色，透射电镜下观察形态改变并拍摄照片。

1.5Westernblot免疫印记法检测人参果总皂苷对相关蛋白表达的影响0.5μg/ml人参果总皂苷分别作用于SPC-A1细胞0h、6h、12h、18h、24h，提取蛋白质进行Western免疫印记法操作，检测周期相关蛋白cyclin及其相关激酶CDK2和CDK1的蛋白表达量。

1.6统计方法实验数据均用SPSS11.0软件进行统计学分析。

2结果

2.1MTT法检测人参果总皂苷对5种人肿瘤细胞增殖的影响表1显示，采用MTT法，人肺腺癌细胞(SPC-A1)、人胃腺癌(SGC-7901)、人宫颈癌细胞(Hela)、人结肠癌细胞(SW-111C)和人神经胶质瘤细胞(U251)等5个人肿瘤细胞株的作用;0.5μg/ml人参果总皂苷作用于5种人肿瘤细胞48h，对5种肿瘤细胞增殖均有不同程度的抑制作用，其中对SPC-A1细胞的作用最强。

2.2人参果总皂苷对SPC-A1细胞形态学电镜观察电镜下观察，未加药物组细胞形态完整，呈略不规则形，细胞表面微绒毛丰富，核呈不规则形，核仁明显，胞质内可见线粒体，嵴清晰，细胞桥小体使细胞彼此黏附连接成完整的单层细胞;加入0.5μg/ml的人参果总皂苷后，随药物作用时间的延长，细胞呈现凋亡改变，药物作用6h可见细胞表面微绒毛脱落，核小，胞质内部分线粒体肿胀，嵴断裂，有较多溶酶体产生;药物作用12h，细胞表面微绒毛消失，核仁明显，胞质内出现大量空泡状结构;药物作用18h，细胞核内异染色体趋边凝聚呈块状，并可见胞质内髓样小体;药物作用24h、30h，已清晰可见细胞膜包裹细胞器或核片段形成典型的凋亡小体。图1显示，通过上述SPC-A1肿瘤细胞在人参果皂苷0.5μg/ml浓度作用下，随着时间的延长(0h、6h、12h、18h、24h和30h)，肺癌细胞在超微结构上发生变化，细胞超微结构出现比较典型的细胞凋亡的特征，从形态学上进一步证明，人生果皂苷诱导肺癌细胞凋亡是其抑制肿瘤细胞生长的作用机制之一。

2.3Western免疫印记法检测人参果总皂苷对相关蛋白表达的影响图2显示，0.5μg/ml人参果总皂苷作用0h、6h、12h、18h、24h，随时间的推进，cyclin和CDK4的蛋白表达逐渐减少，相关激酶CDK2和CDK1的蛋白表达量随药物作用时间的延长均有所增加，推测人参果皂苷可最终引起肿瘤细胞在G2/M期积累，其诱导SPC-A1细胞凋亡与其影响各周期相关蛋白和激酶的表达密切相关。

3讨论

恶性肿瘤的本质是细胞周期调节失控，进而导致细胞无限制的分裂和增殖。细胞周期的调控主要是通过G1/S、G2/M2个关键限制点进行调控。Cyclin-CDK-CKI系统是真核细胞最重要的细胞周期调控系统，CDK是此系统的中心，cyclin具有正性调控的作用，而CKI则为负性调控因子。cyclin因其在细胞周期连续合成不断积累使活性出现周期性变化而得名，是1组结构类似、能结合并调CDK的蛋白质，统称为cyclin家族。细胞周期受细胞周期蛋白(cyclinB1)、细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)及其抑制剂(CKI)的共同调控。cyclinB1在G2/M期检查点发挥重要作用，其水平升高可使细胞周期阻滞在G2/M期的检查点上［3，4］。CDK是一组丝氨酸-苏氨酸(Ser-Thr)蛋白激酶，故称CDK家族。细胞周期检查机制障碍与肿瘤、衰老、凋亡等的发生有密切关系。对于G2/M调控点而言，其进程主要受cyclinB1-CDK1复合物活性调控［5］。肿瘤细胞的G2/M检查点失控，以致在DNA复制出现错误或复制不全的情况下仍然启动M期。cyclinD1-CDK4复合物活性，使细胞阻滞于G1期，并诱发细胞凋亡。同样抑制cyclinB1-CDK1复合物活性及CDK1蛋白表达，亦能使肿瘤细胞阻滞于G2期，并导致细胞凋亡而达到治疗肿瘤的目的［6，7］。本研究结果表明，在离体抗肿瘤实验中，人参果皂苷对5种人肿瘤细胞均有不同程度的抑制作用。对SPC-A1细胞的作用最强，可以诱导SPC-A1细胞凋亡;0.5μg/ml人参果总皂苷作用0h、6h、12h、18h、24h，随着时间的推进，cyclin和CDK4的蛋白表达逐渐减少，相关激酶CDK2和CDK1的蛋白表达量随药物作用时间的延长均有所增加，推测人参果皂苷可最终引起肿瘤细胞在G2/M期积累，其诱导SPC-A1细胞凋亡与其影响各周期相关蛋白和激酶的表达密切相关。推测其抗肿瘤作用机制通过影响细胞周期相关蛋白cyclin及其激酶(CDK1、CDK2等)，使肿瘤细胞堆积于G2/M期，进而诱导凋亡发生而完成抑制肿瘤细胞分裂增殖进而杀死肿瘤细胞的全过程。