酶对造纸流程中生物膜的管控

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本文作者：李洪才（编译）

生物膜的形成会造成工业、环境和健康问题，通常会导致操作故障和产品质量降低。纸厂的过程水中富含营养物质，温度25～45℃，是微生物迅速生长的合适介质。以废纸为原料时，虽然添加剂和水也可能含有少量的污染物质，但大多数微生物是随原料一起进入系统的。在生产过程中，水中细菌类微生物获得了理想的生存条件，不可避免地造成大量细菌生长。由细菌产生的挥发性物质（如有机酸、硫化物和胺类化合物）和生物膜的形成会产生难闻的气味和/或引起产品质量问题。另外，随着废纸用量的增加和水循环系统的封闭（均能导致有机物负荷增加和水回路温度升高），这些问题会使原本已经开始恶化的水系统变得更为严重。

通常而言，生物膜可视为包裹于自产聚合物基体内并黏附在惰性或活性表面的组织化的细菌群落。生物膜所能承受的杀菌剂浓度是杀死同种浮游细菌所需浓度的10～100倍，因此生物膜极难根除。出于各种目的，如保护原料、填料，阻止生物膜沉积和臭味形成，或避免设备腐蚀，通常会在各个工艺部位使用杀菌剂，如氯、溴、碘、戊二醛及其他物质。但是，有些微生物会对杀菌剂产生抗药性，这就需要研发新的微生物控制剂。另外，杀菌剂有时无法渗入生物膜并将其去除。而且，大多数抗菌剂对环境有害，可能成为水和环境污染问题的潜在来源。阻止微生物淤积的方案应当对环境友好，应阻止微生物与表面接触和/或阻止群生微生物积累到可能会产生问题的水平，方案之一是分散剂的使用。

分散剂可作为一种单一添加剂用于过程水中，以阻止生物膜的形成，也可与微生物敏感型原料的杀菌剂处理配合使用。分散剂并不是都能杀死或抑制细菌的生长，尽管一些分散剂对能形成生物膜的细菌表现出选择性抑制作用。由于这一原因，不应该仅仅依靠细菌数量来确定分散剂最佳用量和评估它们的作用效果。分散剂可通过降低水渗透阻力、增加水分留着或通过增加起泡性影响纸张的化学性质。用于生物膜控制系统的分散剂也能作用于其他的非生物膜沉积物，因此使用这些分散剂时应该考虑其对整个造纸过程的影响。杀菌剂的另一种选择是使用酶处理技术。酶可以通过4种不同方式影响微生物的集群和黏附：①酶会作用于沉积微生物的胶黏物，从而预防沉淀现象；②酶可降解生物膜基质（通过增生形成）上的聚合物和沉积的微生物；③酶可催化表面防污化合物的释放，这些化合物可能有毒也可能没毒，但它们比传统杀菌剂更不稳定，应该能够预防有害化学品的生物富集问题；④表面集群过程中微生物细胞间的联系可能被特定的酶所阻止。

开发用于造纸过程的有效酶产品主要有2种方法：①鉴定生物膜中存在的多糖，并寻找可降解它们的特定酶；②鉴定不同酶产品中的活性物质，评估它们对生物膜的影响。酶模型反应的专一性使第二种方法的技术较为复杂，增加了鉴定酶能否有效防止所有种类生物膜形成的困难。因此，包含几种酶的配方似乎成为生物膜控制方案成功的关键。第二种方法还未在公开报道的研究中进行过尝试，关于专一性酶对造纸过程中生物膜的影响的研究较少。已经有人对果聚糖水解酶和Darazyme的系列产品进行过研究，Darazyme由GraceDearborn团队研发，根据生物膜化合物的初步鉴定，随后运用一种酶或有针对性挑选的酶混合物来降解已鉴定的多糖。本研究着重于第二种方法，对比了17种商品非专一性酶产品对生物膜的预防和降解能力，其中生物膜由纸厂分离出的细菌形成。

1实　验

1.1　酶

评价了不是专门为生物膜处理而开发的17种商品酶产品（来自NovozymesA/S，Krogshoejvej36，DK-2880Bagsvaerd，丹麦）对生物膜的影响。表1为17种酶产品的主要活性。

1.2　实验设备

使用2种连续-流动生物反应器研究了酶对生物膜形成的影响，生物反应器的容量为300mL（B300）和10L（B10）。这种设计旨在让生物膜在试样上生长，这是对1982年发明的实验室规模Pedersen设备的改进。槽的入口通过硅管（B300）或PVC管（B10）与蠕动泵和过程水槽相连，出口循环至槽子（见图1）。每个流动室包含10个PVC试样，间隔为5mm。回路中液体的总容量分别为300mL和10L。用离心泵输送这些液体，流速为0.29L/s。新鲜过程水从进料槽连续泵入搅拌槽（B300：50mL/d；B10：250mL/d）。通过排出搅拌槽的过量过程水，而使过程水的总体积保持不变。通过试样槽的水流为0.10L/s，以此保持湍流状态。因为流体动力学条件显著影响着生物膜的形成，而且纸厂的流体动力学条件很难在实验室规模中再现，因此分别在层流和湍流2种动力学条件下研究了酶对生物膜形成的影响，从而可以通过与对照实验的比较确定每种处理对生物膜形成的影响。

1.3　实验流程

1.3.1　实验室预实验（B300）

实验开始前，用除垢剂和乙醇将生物反应器洗净，再用无菌蒸馏水清洗。用丙酮和乙醇对试样进行脱酯和杀菌处理后，用无菌蒸馏水洗涤，置于流动室内。向生物反应器内接种过程水中出现的菌群，过程水取自某个以100%废纸（混合废纸，产品为纸板）为原料的纸厂的网部成形区（工厂1）。实验在pH值6.8～7.0、30℃温度下进行。研究了17种酶混合物。所有实验中商品酶制剂用量均为0.1%。用B300反应器进行了4天多的实验，每24h打开流动室取出2个试样。一个试样用于测定生物膜的形成量，以105℃下干燥6h后的绝干质量（mg/m2）为基准。另一个试样用于测定试样每单位面积上的菌落形成单位数量Ns（CFU/cm2）。后一种测定中，试样用无菌钳移出，用9mL无菌生理盐水洗涤以去除轻微黏附的细胞和多余的水分。用无菌棉绒棒在每个试样的一侧擦除生物膜，转移到含一定量无菌生理盐水的小瓶中。摇晃悬浮液（20s）以分散细胞。然后对所得的每个样品进行一系列稀释，涂在平板计数琼脂上。平板在30℃下培养48h。然后测定每平方厘米上形成的菌落形成单位数量。在相同的时间间隔内，在生物反应器的水介质中无菌取样，并测定每毫升的菌落形成单位数量Nv（CFU/mL）。在这些预实验结果中选择3种处理方法进一步在B10L反应器中进行研究。

1.3.2　实验室实验（B10）

进行了4天多的实验，每24h取一次水样和试样，根据B300实验中的方法通过计数和称量质量测定试样上的生物膜形成量。实验采用工厂1中的过程水。这种过程水富含纤维、细小纤维和填料，取自网部成形区，并在15℃下贮存。在用于B10L实验前，过程水依次用1mm、600m、400m、200m和63m过滤器过滤，类似于工厂中使用多盘过滤处理获得澄清水。

由试样上菌落形成单位数量总数（A）和与试样接触的菌落形成单位数量总数（C）的比值计算集群比（CR），如公式（1）所示。后者（C）被定义为介质中的菌落形成单位数量总数（B）和试样上菌落形成单位数量总数（A）之和，如公式（2）所示。A和B根据公式（3）和公式（4）确定，其中CS为试样表面积（cm2），TVL是反应器内液体的总体积（mL）。采用这种方法，不同初始条件下的实验可以进行比较。

CR（%）=AC×100%　（1）C=A+B（2）A=Ns（CFU/cm2）×CS　（3）B=Nv（CFU/mL）×TLV　（4）最后，只选择一种商品酶产品进行进一步实验。首先在B10反应器中进行10天以上的实验。为确保细菌数量在整个实验过程中保持恒定，每24h对介质中的细菌进行一次计数，实验测得过程水中的细菌浓度保持在106～107CFU/mL。通过测定沉积在试样上的生物膜绝干质量，每24h评估一次生物膜的积累情况。

1.3.3　中试回路试验

为确定对阻止生物膜形成起主要作用的有效成分，还研究了2种商品酶产品，其包含从17种商品酶产品中挑选出的最有效酶产品。此组试验在中试回路中进行，中试回路模拟了一个纸厂内的过程水回路并考虑到了新鲜水的加入和多余水的去除。

中试回路包括2个由NewBrunswickScientific公司（USA）制造的生物反应器BioFlo3000，其中1个用于测试处理效果，另一个用于对比，使细菌在一个可控环境下生长：温度45℃，pH值7，溶解氧高达20%，湍流状态（雷诺数>2000）。将高密度聚丙烯试样浸入每个反应器中，以便形成沉淀物。试验采用的过程水取自以100%废纸为原料生产书写和印刷纸的纸厂（工厂2）。同样，这些水取自网部成形区并在15℃下贮存。在用于中试试验之前，过程水按B10L实验所述流程进行过滤。

为测试酶处理对防止生物膜形成的能力，从试验开始到结束的10天内连续添加酶使其浓度保持在恒定质量分数0.1%。每天通过干燥-再水合薄膜法（Petrifilm3MTM）测定水中好氧细菌的总群落数。计数结果以菌落形成单位数量（CFU/mL）表示。在试验的最后，测定试样上形成的生物膜总绝干质量。

为排除酶产品中非酶成分的影响，用工厂2中的过程水在干净的回路中进行变性酶试验。酶在121℃下加热30min后失活。试验过程中连续加入失活酶以保持恒定质量分数0.1%，并与对比试验（无酶）中生物膜的形成进行了对比。在干净回路中，采用不同用量的最佳酶产品进行了试验。在3个生物反应器中连续进行，并向生物反应器中加入工厂2的过程水。测试了酶在3个不同的质量分数（0.01%、0.001%和0.0001%）下的情况。第4个反应器用于对照试验（无酶处理）。

2结　果

2.1　实验室预实验

表1为酶对生物膜形成的影响（定性）。测试的17种酶中，PectinexSmash对活性菌落吸附于试样和生物膜形成的预防效果最佳。ViscozymeL、Pulpzyme、Terminox和Bio-feedBetaL的效果次之。虽然用Novozyme863h处理时，试样上测得的菌落形成单位数量相当少，但对生物膜的形成无阻止效果，这在意料之外。因此，选择Novozyme863h、PectinexSmash和ViscozymeL进行进一步研究。

2.2　实验室实验（B10）

所选酶产品在B10实验中的结果如图2所示。图2显示了介质中的菌落形成单位数量（CFU/mL）、试样上单位面积上的活菌数量（CFU/cm2）、试样上的生物膜绝干质量和集群比。通过沉积在试样上的生物膜的绝干质量增加值和集群比来评估生物膜的形成。绝干质量的增加是由细菌集群和胞外多糖（EPS）的生成引起的。集群比的增大表明了生物膜的形成。由图2可知，随着反应时间的增加，酶的添加没有改变介质内每毫升中的菌落形成单位值，这个值在所有的实验中都保持恒定，并与对照样品的测定值相似。这表明，所测试的酶制剂没有所希望的杀菌效果。

当不添加酶时（对照实验），试样上的菌落形成单位数量和试样上的生物膜绝干质量都增加了，然而，介质中菌落形成单位数量基本稳定。这表明，细菌群集于试样表面并生成生物膜。实际上，24h后生物膜就已经形成，且随着实验的进行而增加。48h后集群比迅速增加，96h后集群比接近100%，这说明试样生物膜上的细菌几乎都是活的。当使用酶处理时，在开始的24h，试样上每平方厘米内的活性菌落形成单位数量有所增加，其值比对照实验中得到的结果更高。这个意想不到的效果与其他研究人员的观察结果一致，他们已经证明，盐类、消毒水或其他化合物、其他细菌能增加细菌的黏附作用，甚至生物膜的熟化。然而，初期增长过后，每平方厘米上的活性菌落形成单位数量保持不变（见图2中Novozyme863和PectinexSmash的结果）；72h后甚至稍有下降（ViscozymeL的情况）。结果发现，酶处理实验中集群比保持在20%以下，且细菌在试样表面上群集或增长的最终值比对照实验还低。Novozyme863和ViscozymeL对沉积在试样上的生物膜绝干质量的影响比PectinexSmash的影响明显要小。Novozyme863和ViscozymeL的添加不会阻止有机物在试样上的积累，尽管它们限制了有机物的积累，且最终值比对照实验最终值的1/2还少。然而，PectinexSmash的添加能阻止有机物在试样上的积累，其质量保持在0.2mg/cm2以下。此外，在整个实验过程中集群比都较低，表明酶处理通过限制集群在试样表面的细菌数量和减少试样上生物质的生成来减少试样表面的生物膜的总量。因此，选择PectinexSmash继续进行中试回路试验研究。

2.3　中试回路试验

在中试回路试验中，所有情况下水中的细菌含量均保持在2.3×106～7×107之间。未进行酶处理时，试验72h后肉眼就可明显观察到试样表面形成的生物膜。添加PectinexSmash时生物反应器中试样上沉积的生物膜绝干质量为无酶处理时的1/4～1/3（见图3）。因此湍流条件下，在干净回路中添加PectinexSmash能显著限制生物反应器中聚丙烯试样上生物膜的生成。

2.4　失活PectinexSmash试验

在失活PectinexSmash试验中，水中的细菌总数变化不明显（107～108CFU/mL）。使用失活PectinexSmash处理和无任何处理时，未观察到生物反应器中试样上沉积的生物膜绝干质量有明显差异（260h后测得试样上增加的绝干质量均在（1.4±0.3）mg/cm2范围内）。这些结果表明，PectinexSmash对生物膜形成的预防性能并不是由于其中的非酶成分造成的。

2.5　PectinexSmash剂量的影响

在实验进行的190h期间，未观察到4个生物反应器中的细菌总数有显著差异。24h后，无酶处理和酶用量为0.0001%的PectinexSmash处理中，肉眼可明显观察到生物反应器中试样上形成的生物膜。酶用量为0.001%和0.01%的生物反应器中，48h后才能肉眼观察到试样上的生物膜。无酶处理和用量为0.0001%的PectinexSmash处理中，生物反应器试样上的生物膜绝干质量很接近，表明PectinexSmash用量为0.0001%时不影响生物膜的生成（见图4）。PectinexSmash用量为0.001%时可观察到酶对生物膜积累的预防效果一般，使试样上生物膜绝干质量降低了50%。然而，酶用量为0.01%时，PectinexSmash显著阻碍了生物膜的形成，因为此用量下试样上的生物膜绝干质量为无酶处理时的1/5。因此，PectinexSmarsh在用量为0.01%和0.1%时的作用效果相当。

2.6　主要酶成分的鉴定

如先前的实验所述，由于PectinexSmash性能最佳，故进行了更多的实验以进一步证实它对未过滤水（含有纤维、细小纤维和填料，这些物质会影响生物膜的形成）中生物膜形成的阻止效果。PectinexSmash是一种从曲霉属真菌中提取的产品，具有较宽的酶活性范围，因为它们之间含有各种果胶活性物质——果胶甲基酯酶。为鉴定对抑制生物膜形成起主导作用的活性物质，在B10反应器中研究了2种含有PectinexSmash活性成分的相关产品，即PectinexUltraSP（从曲霉属真菌中提取的果胶酶混合物）和Novoshape（主要活性酶为从曲霉属真菌中提取的果胶甲基酯酶）。图5显示了这些酶产品的作用效果。图5可知，PectinexUltraSP对生物膜的形成没有影响，而PectinexSmash处理对控制生物膜的形成是有效的，试样上生物膜的绝干质量为对照实验的1/3。Novoshape处理结果表明，试样上生物膜的绝干质量为对照实验的1/4。PectinexSmash和Novoshape制剂中都含有果胶甲基酯酶。因此可得出结论，果胶甲基酯酶是造成PectinexSmash具有预防和控制生物膜功能的主要酶，或至少是其中的一种酶。

3讨　论

实验结果表明，研究的17种酶产品中，PectinexSmash及Novoshape是预防生物膜形成的最有效方法（它们都主要由果胶甲基酯酶组成）。PectinexSmash是一种果胶酶活性成分的混合物，Novoshape是一种微生物果胶甲基酯酶溶液（PME，E.C.1.1.11）。酯酶的编码基因来自曲霉属真菌，可转移到食品级微生物-米曲霉的分子链中，从而用于工业生产。Novoshape制剂的活性为10PEU/mL，最佳温度约50℃（数据由制造商提供）。这种酶属于碳水化合物酯酶属，能催化甲基酯基团的水解，对果胶底物有高度选择性，此特性在食品工业和植物学中应用广泛。目前，生物膜多糖的组成还不完全清楚，但关于浮游生物的胞外聚合物（EPS）和少量生物膜EPS的现有数据表明，它们的一些单体与植物细胞壁物质完全相同或相似。实际上已有报道称，一些细菌EPS是酶混合物（不是来自细菌）的基质。

Orgaz等人在关于生物膜去除的案例研究中得出结论，对于荧光假单胞菌生物膜的去除，由绿色木霉菌（与果胶甲基酯酶同属）产生的果胶酯酶可能使生物基质中的多糖去乙酰基化，使其更松软并具有更多孔隙。许多微生物EPS具有不同的取代基，如缩酮连接的丙酮酸酯基或酯连接的乙酰基。酰基，尤其是醋酸酯的去除能显著影响多糖的物理性质。一种取代基的去除会影响EPS的物理特性，如乙酰基，特别是醋酸酯。

通过分泌各种酶，一些真菌可降解复杂的植物细胞壁物质。这种多功能性使得商品多糖降解酶混合物在多种领域广泛应用，如水果加工或废水处理。它们还能用于降解细菌生物膜基质或预防和控制造纸厂废水管道系统内生物膜的形成。因为EPS的多相性，酶混合物对生物膜的有效降解是必需的。

高效酶能够去除浸没在水内的生物膜，这种方法可以与杀菌剂一起使用，本研究为这种方法的使用奠定了基础。酶能生物降解且毒性低，它的使用能减少杀菌剂的使用，因而对环境友好且具有经济优势。